乳癌の免疫染色 Immunohistochemistry of Breast Cancer

★p63
筋上皮マーカー。筋上皮は陽性、管腔細胞は陰性。
p63陽性細胞で囲まれた細胞集団は乳管内病変と認識できる。
通常の浸潤性乳癌はp63陰性。
腺様嚢胞癌、腺扁平上皮癌, 悪性腺筋上皮腫, 悪性筋上皮種, 化生癌は浸潤がんでもp63陽性。

★CK5 or CK5/6 (CK5推奨: Bhargawa R et al. Am J Clin Pathol 2008;130:724-730)
主に筋上皮に反応する。
通常型乳管過形成ではモザイク状にCK5/6強陽性を示す。
columnar cell change, flat epithelial atypia, 異型乳管過形成とDCISはCK5/6陰性。
basal-like DCISは陽性となる。

乳頭状パターン+充実性増殖の 鑑別
乳頭状増殖に充実性増殖が加わると、乳頭腫と異型乳管過形成(異型乳頭腫)やDCISの合併，あるいは充実性乳頭状に増殖するendocrine DCISとの鑑別が問題となる。
以下の3つのうち2つ以上を満たす場合，悪性の可能性が高い。

1. 筋 上皮(p63, calponin)が<10%
2. CK5/6 <10%
3. chromogranin A ≥ 10% [endocrine DCIS]

★GCDFP-15
15kDの糖蛋白。乳癌での陽性率は62-77%。汗腺（アポクリン腺）腫瘍, 唾液腺腫瘍も染まるが，乳癌に比較的特異的なため転移性腫瘍の原発巣推定に有用。
組み合わせ例
    肺癌との鑑別にはTTF-1,
    卵巣漿液腺癌との鑑別にはWT1,
    メラノーマとの鑑別にはHMB45(S-100は両方陽性になるので)
胃癌でERが染まることがある。

★Mammaglobin
10kDの糖蛋白。乳癌の半数以上で陽性。汗腺を除くほとんどの正常組織は陰性。
mammaglobinの感度が高く，GCDFP-15は特異度が高いと の報告あり(Bhargava R, et al. Am J Clin Pathol. 2007;127:103-13.)，カクテル抗体が市販されて いる。

★E-cadherin, beta-catenin
小葉癌はE-cadherin陰性, beta-catenin陰性である。

★EMA (MUC1)
微小乳頭癌 micropapillary carcinomaではMUC-1やEMAで腫瘍胞巣の表面が陽性となる。

★HER2
乳腺Paget病の80-90%がHER2陽性。

(市原 & 森谷. がん情報サービス, 2008などを参考)

京都大学ルール
乳癌でtriple negative (ER-, PR-, HER2-)のときの追加染色　AR, (CK5), EGFR, PD-L1 (SP142)

HER2の免疫組織化学法(Immunohistochemistry, IHC) 観察手順
観察手順
     1. まず4倍対物レンズ (a 4x objective lens; 4x は four-times と発音) で浸潤部分の乳癌細胞を探す。
　　  非浸潤部分(DCIS)の癌細胞は検索対象から除外する。

     2. 染色の特異性、強度を確認する。

     3. 10倍対物レンズに切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認。

　強い (strong) 完全な細胞膜の陽性染色は対物10倍で確認できる。(たぶん、 4倍でも)

    中程度の細胞膜の陽性染色は対物20倍で確認できる。(たぶん、10倍でも)

    弱い細胞膜の陽性染色は20倍でようやく確認できる。

　　対物20倍で「魚をとる網様 (fishnet pattern)」にみえない場合は，ほとんどが陰性と判定とされる
      対物40倍でかすかに染まっているのがわかる程度は、陰性

　　細胞質のみに陽性所見がみられる場合は，判定対象外であり陰性

・IHC 3+ based on [circumferential membrane staining that is complete, intense] in >10% of the tumor cells ・IHC 2+ based on circumferential membrane staining that is [weak to moderate complete membrane] and [in >10% of the invasive tumor cells]; 「>10%だが染まりが弱い」  or [complete and circumferential membrane staining that is intense and within ≤10% of the invasive tumor cells]「10%以下で強い染まり」 ・IHC 1+ as defined by Incomplete membrane staining that is faint/barely perceptible  and in >10% of the invasive tumor cells「>10%だがかすかな染色」 IHC 1+ か IHC 0 かを判定するときは必ず高倍率 (40X) で観察 ・IHC 0 as defined by No staining observed  or membrane staining that is incomplete and is faint/barely perceptible and in ≤10% of the invasive tumor cells 「10%以下かすかな染色」

参考1: 胃癌のHER2の判定は管腔側以外(basolateral)の陽性像で判定する。
参考2: 大腸癌のEGFRの免疫染色は陽性は細胞膜に少しでも(細胞質の染色強度を超える)陽性シグナルが認められれば 陽性。連続性もシグナル強度も問われない。

DISH法 (dual color in situ hybridization) HER2遺伝子判定

JUNE 07 2023 のまとめ（2018年版の再確認）

HER2 IHC	かすか(40x)-無 不完全	弱〜中(20x) 完全	強 (10x) 完全
範囲>10%	陰性 1+	曖昧 2+	陽性 3+
範囲≤10%	陰性 0	陰性 1+	曖昧 2+

IHC 2+ (曖昧 2+) について，DISH (Dual in situ hybridization) を実施する

	HER2 signals/cell　陽性判断には4以上が必要
HER2/CEP17	<4.0	4.0〜6.0	≥6.0
≥2.0	陰性（注釈付）	陽性	陽性
<2.0	陰性	陰性疑いIHC再検査 それでも同じなら陰性	陽性疑いIHC再検査 それでも同じなら陽性

Wolff AC, et al. Arch Pathol Lab Med (2023)
https://meridian.allenpress.com/aplm/article/doi/10.5858/arpa.2023-0950-SA/493531/Human-Epidermal-Growth-Factor-Receptor-2-Testing

======

Ki-67 (MIB-1) index [Dowsett M, et al. J Natl Cancer Inst 2011;103:1–9]

(案1) Ki-67インデックスは陽性細胞が最も多い場所で1000個数えてパーセントで表す。MIB-1 はKi-67に対する抗体(クローン)名
　 The proliferation index was assessed by counting 1000 cells in the "hot spot".

(案2) Recommendations for Ki67 assessment in breast cancer 抜粋
乳癌における推奨されるKi67評価法

Interpretation and scoring
解釈とスコアリング

•    In full sections, at least three high-power (×40 objective) fields should be selected to represent the spectrum of staining seen on initial overview of the whole section.
腫瘍全体を含む切片では，少なくとも3つの強拡視野(対物レンズ40倍)を選び，切片全体を最初に見渡したときの染色が見られる範囲を代表する部分が含ま れるようにする。

•    For the purpose of prognostic evaluation, the invasive edge of the tumor should be scored.
予後評価の目的では，腫瘍の辺縁部を数える。

•    If pharmacodynamic comparisons must be between core cuts and sections from the excision, assessment of the latter should be across the whole tumor.
治療によるKi67の変化を針生検と切除検体で比較する場合は，後者は腫瘍全体を横切るように評価する。

•    If there are clear hot spots, data from these should be included in the overall score.
明瞭な密集点(Ki67が周囲より特に高い部分)がある場合，それらを含めて全体を評価する。

•    Only nuclear staining is considered positive. Staining intensity is not relevant.
核染色のみを陽性とする。染色強度は無関係。

•    Scoring should involve the counting of at least 500 malignant invasive cells (and preferably at least 1000 cells) unless a protocol clearly states reasons for fewer being acceptable.
スコアリングには少なくとも500個の浸潤がん細胞を数える(少なくとも1000個が望ましい)。実施要項でより少なくても可とする理由を明確に述べてい る場合はこの限りではない。

•    Image analysis methods for Ki67 remain to be proven for use in clinical practice.
Ki67の画像解析法を臨床現場で使用できるかどうかは証明されていない。

Estrogen receptor alpha (ER) 免疫染色の判定

　ERは染色強度 (weak, moderate, strong) にかかわらず1%以上の陽性細胞があれば内分泌療法の適応と考えることが推奨されている (St. Gallenコンセンサス会議, 2009年, WHO 第4版 2012年)。腫瘍切片全体として総合的に判定する。結果は%表示。

陰性 Negative：1%未満 低陽性 Low Positive：1-10% 陽性 Positive：10%超える場合は10%刻みで報告

参考：ER染色のAllred score (1998)

Proportion Score (0〜5):

Intensity Score (0〜3):

Total score (TS) = Proportion Score (0〜5) + Intensity score (0〜3)

3点以上を陽性とする(陽性部分が1%以上あれば3点以上になる!)　大 抵は0点になるか7-8点になる。

たとえば，15% 染まっていて, 強さが中等度 (intermediate) であれば

Allred TS = PS3 (15%) + IS2 = 5 (点)

Progesterone Receptor (PgR) は 1-10%でも陽性と判断する．