京大病院では技師がFCMを解釈してくれている...が他施設では一般的でない．通常，FCMの分析結果は，ドットプロット dot plot やヒストグラム histogram で表示され，それを病理医が解釈する．

FCMとH&E染色と免疫染色があれば，悪性リンパ腫のほとんどは診断可能

H&Eが「よく読める」ようになるためにも，常に「FCM」のデータを参照する

FCMで解析する目的：
正常細胞が混在している試料の中から，CD (Cluster of Differentiation) の発現パターンにより，異常細胞群 (abnormal cell population, ACP）の表面形質を知ることである
    dot plot では，文字通り，ACPが群れを成している...

FCM情報の正しい解釈がなければ，ムダに免疫染色をオーダーして医療資源を浪費するの みでなく，間違った診断をしてしまうかも知れない

悪性リンパ腫の病理診断では，通常，FCMの結果を確認してから， IHC のセット（パネル）を決定する．

組織形態からみてFCMの結果が妥当と判断される場合 (concordance case) ，
免疫染色（IHC）でもう一度，FCM解析済みの抗原を確認する必要はほとんどない．

    FCMは，主として細胞表面抗原を解析対象とする．

    IHCでは，主として細胞質内や核内の抗原を解析対象とする．

FCMの結果とHE染色をふまえたIHCのパネル例

FCM	HE	IHC ⇒ DLBCL の鑑別・亜分類に注力
CD5-　CD10- CD20+　 Sm-IgG+　 Sm-kappa+	大型リンパ球 （中心芽球様） びまん性増殖	PAX5（核）　bcl-2（細胞質） bcl-6（核）　MUM1（核） c-myc（核）　Ki-67（核） EBER-ISH（核）

パネル例　
 FCMで検討済みの抗原はIHCで省略可能！？(Mason EF. Int J Lab Hematol. 2017)

FCMの結果	小〜中細胞 の場合	大細胞の場合	注意
CD5陽性のBリンパ腫疑 (MCL/CLL vs. DLBCL)	Cylin D1 Ki-67	BSAP, BCL2, BCL6, MUM1, MYC, EBER Ki-67	BSAP (PAX5) は時に染色不良になる可能性 MYC, EBER は optional かも
CD10陽性のBリンパ腫 (FL vs BL vs DLBCL)	BCL2 BCL6 CD21 Ki-67	BSAP, BCL2, BCL6, MUM1, MYC, EBER Ki-67	BLではCD3が有用かも（ほとんど腫瘍間にTリンパ球がない）
CD5陰性，CD10陰性の Bリンパ腫 (MZL vs DLBCL)	IRTA1 AE1/AE3 (CD3 CD20) (κ/λ) (TdT)	BSAP, BCL2, BCL6, MUM1, MYC, EBER Ki-67 (IMP3)	marginal zone 疑いではIRTA1を推奨 腫瘍量が少ないDLBCLでは IMP3が有用かも
? Hodgkinリンパ腫	(IMP3)	CD15 CD20 CD30 PAX5 EBER (CD3) (fascin)	PAX5は「かなり薄い」ことがポイント 小型腫瘍でもIMP3陽性となる
T細胞性 AITL vs ATL vs NOS	foxp3 (ATL) CD10 CD21 CXCL13 PD1 (AITL)	ALK (CD3) CD30 EBER granzyme B	T細胞性腫瘍の「核」を高率に染める抗体がない
NK細胞性	CD3 CD56 EBER

【用語】

FCMでは，2種類の散乱光 (FSC, SSC)と，蛍光（各々の標識抗体からでる）を個々の細胞について測定する．

その分布をグラフにして表している．

前方散乱光 forward scatter (FSC)　＝　細胞の表面積（大きさ）に比例

側方散乱光 side scatter (SSC)　＝　細胞内構造の複雑さ（≒顆粒，細胞内小器官の量）に比例

　FSC, SSCの違いで，リンパ球，単球，顆粒球がおよそ分けられる

　リンパ腫の多くはFSC大（= 大きな細胞）
    FSC小の細胞が ACP を含む　⇒　低悪性度リンパ腫の可能性

蛍光　=　細胞表面の抗原量に比例
            　通常，数十種類の抗体を反応させる
                dot plot では，1個の点が，1個の細胞に対応する



【正常細胞マーカー】
まず，正常の細胞について暗記する
特にことわらない限り，細胞表面 (Sm, あるいはsで表現)は省略．細胞質抗原は cyで表記．

T細胞： (CD1) CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 TCR
    CD1aはランゲルハンス細胞でも陽性，
    CD4は単球・組織球でも陽性,
    CD5は一部のB細胞で陽性
    CD8は脾臓血管内皮で陽性

B細胞： CD19, CD20, CD22, CD23, cyCD79a, Sm-IgA, Sm-IgG, Sm-IgM, Sm-IgD, Sm-kappa, Sm-lambda
    リンパ芽球・中心芽球　CD10+
    形質細胞　CD20- CD38++  cyIgA, cyIgG, cyIgM, cyIgD, cykappa, cylambda

NK細胞：CD2dim CD7 CD8 CD16 CD56 CD57 (CD3- TCR-)

単球/マクロファージ：CD4dim CD13, CD14, CD33, CD64, CD68, CD80 (M1), CD163 (M2),

顆粒球　cyMPO; CD11c CD13  (CD15) CD33 CD65(顆粒球) CD117(マスト細胞) CD123 (pDCs)
    未熟な骨髄球性細胞　CD34  CD117

赤芽球 (CD71, 赤芽球) CD235a（赤血球も）

巨核球 CD41 CD42b CD61




【異常細胞群 (ACP) ＝腫瘍，の判定】

1) kappa: lambda 比の異常

1つのB細胞では1つの軽鎖遺伝子の再構成しかない．κとλを同時に発現することはない
（2番染色体上のκ遺伝子の再構成に失敗すると22番染色体上のλ遺伝子が再構成される）

κ : λの組織中で正常な比率は約 2:1．
    　ただし，血液中の遊離軽鎖アッセイの場合 κ/λ の正常値は0.26〜1.65（Katzmann JA, et al. Clin Chem 2002）

　とりあえず，およそ Kappa/Lambda >3，または<0.5  ⇒ B細胞性腫瘍疑い，と考えてみる
　（サイコロで奇数の目だけ続けて出たり，偶数の目だけ続けて出るようなもの...）

    カットオフの適正値は，厳密に決められない（測定法や反応性細胞の含まれる割合に依存するため）

    皮膚B細胞性リンパ腫（ベンタナ ISH）　> 3 or <1 (Magro C, et al. J Cutan Pathol 2003)

    骨髄浸潤した濾胞性リンパ腫（ROC解析，FCM)　> 4 or < 0.3 (Iancu D, et al. Arch Pathol Lab Med 2007)

1') B細胞で汎Bマーカー（CD19, CD20, CD22, HLA-DR, Sm-Ig ) が欠失 ⇒腫瘍 (cf. Kaleem Z et al. Am J Clin Pathol 2000)，
        HLA-DRの消失：CNSリンパ腫など

2) T細胞で汎T細胞抗原の欠失
　CD2, CD3, CD5, CD7のいずれかが欠失しているとき，T細胞性腫瘍（疑い）．

　細胞表面 CD3 (sCD3, FCMで測定) 陰性，細胞質内 CD3 (cyCD3, IHCで染色) 陽性も，腫瘍パターン．

　CD4/8比ではT細胞性腫瘍を判定できない (e.g. HIV感染)．

3) 通常ほとんどない細胞が多数出現

　末梢組織に稀な細胞が多数 (e.g. 10%以上) 出現したら腫瘍を考える

    CD5+ B細胞 (マントル細胞リンパ腫など)

    CD1a+　T細胞（急性白血病）（胸腺型形質，胸腺ではフツー）

    CD4+ CD8+ T細胞（CD3 ≒ CD4 + CD8 が成立しない場合）

    CD10+ T細胞 (血管免疫芽球型T細胞リンパ腫)

    CD25++ T細胞 (成人T細胞白血病)

    TCRγδ+ T細胞 (肝脾リンパ腫)

    CD30+ 細胞 (未分化大細胞リンパ腫，EBV関連リンパ腫の一部)
          CD30+細胞は活性化リンパ球（免疫芽球）の指標

    CD56+ 細胞 (NK/T細胞リンパ腫)

　cf. 白血病：分類・予後因子は染色体／遺伝子解析の占める割合が大きくリンパ腫ほど重視されない
                AML M3：HLA-DR陰性
                AML M2：CD19+ and/or CD56+
                Ph1+ ALL：CD66c+

　cf. リンパ芽球性リンパ腫：TdT+（= 未熟リンパ球）（核抗原）
   　 TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) = DNAの3'末端に（ランダムに）塩基を付加する酵素
    　V-J, V-D-J 結合の間に，nontemplated nucleotidesを数塩基つないで抗体の多様性を生み出す
    　PCRでクローナリティを判定するときの，PCR産物の分子量の違いにも関与してくる
        Merkel cell carcinoma と小細胞癌 が陽性になることがある (Sur M et al. Mod Pathol 2007)

4) aneuploidy の存在
　DNAに結合する蛍光色素によりDNA量の解析もできる
　aneuploidy があれば，腫瘍

      

【免疫組織化学】
下記は，一般的にFCMでは判定しないマーカー．IHCで判定する．

ALK: 正常リンパ球では陰性．

bcl-2：正常の胚中心B細胞では陰性．
             濾胞性リンパ腫でも，約1割は陰性

bcl-6: 胚細胞中心マーカー．
            Hans classifierでは30%をカットオフ値としてMUM1と併用する．

CD21: 濾胞樹状細胞 (FDC) で陽性．
            FDCの分布パターンが，濾胞性リンパ腫の診断や血管免疫芽球型T細胞リンパ腫 (AITL) の診断に有用．
            CD21が薄いとき，CD23を補助的に使うことがある

Cyclin D1：CD5+リンパ球で陽性 ⇒ マントル細胞リンパ腫

CD56+ あるいは cyclin D1+ の形質細胞⇒ 骨髄腫細胞（cyclin D1+の形質細胞はCD20, PAX5も陽性）
         (Van Camp B et al. Blood 1990; Vasef MA et al. Mod Pathol 1997)

EBER ISH：正常の末梢組織で陽性細胞はほとんどない（e.g. <1/20 hpf）．
    他のEBV抗原であるLMP-1やEBNA2の染色が診断に必要になることは少ない

IMP3：正常リンパ球は陰性（胚中心B細胞を除く）
                DLBCLの大半で陽性

Ki-67: リンパ腫疑い検体では，Ki-67の免疫染色が望ましいと思う

　1) 濾胞性リンパ腫と反応性濾胞の区別（染色パターンが異なる）

　2) マントル細胞リンパ腫の悪性度判定

　3) びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の区別

　4) 小検体 （e.g. 針生検検体）での低悪性度リンパ腫と高悪性度リンパ腫の区別（推定）

　暗帯・明帯の区別が明瞭なら，反応性濾胞
　Ki-67低値 (e.g. <30〜40%)は低悪性度リンパ腫を考慮
　Ki-67高値 (e.g. ≥40%)は高悪性度リンパ腫を考慮
　非常高値 (>95%)は Burkittリンパ腫を考慮

MUM1 (Multiple Myeloma 1 / Interferon Regulatory Factor 4 protein) :
　後胚中心のB細胞で核に陽性
    非腫瘍性B細胞ではBCL6と排他的に発現

PAX5 (= BSAP, B-cell lineage specific activator protein）：B細胞の核に陽性
    陽性腫瘍：ほとんど(>90%)のB細胞リンパ腫で陽性
　Merkel cell carcinoma (>70%) と small cell carcinoma, NECの一部にも陽性となる
　陰性腫瘍：T細胞性腫瘍，ほとんどの形質細胞腫瘍，上皮性腫瘍
    　PAX8ポリクローナル抗体はPAX5に対する交差反応があるため，解釈に注意が必要

PD-1: 濾胞性Tリンパ球の細胞膜で強陽性，他のTリンパ球で弱陽性
            AITLで陽性になることがある

PD-L1：リンパ腫の一部ではPDリガンドの遺伝子増幅．転座あり．
　ホジキンリンパ腫，未分化大細胞リンパ腫，NK/T細胞，EBV関連B細胞リンパ腫などで発現
     (Inaguma S et al. Am J Surg Pathol 2016)  (Chen BJ et al. Clin Cancer Res 2013)

       腫瘍随伴マクロファージは，PD-L1陽性，CD163陽性 (M2-like)が多い
　　(Heeren AM et al. Mod Pathol 2016)

PU.1
　PU.1は11番染色体上にあるSPI1遺伝子にコードされている，
    purine-rich DNA sequence (PU-box, 5'-GAGGAA-3')に結合するエンハンサー．

　PU.1 強陽性：組織球＆組織球系腫瘍　(Muirhead D et al. Am J Dermatopathol 2009)．

　PU.1 中等度陽性：正常のB細胞（一部の胚中心細胞が強陽性，他は中等度陽性）．濾胞性リンパ腫とLPHDも陽性．
　
　PU.1 陰性：T細胞 & 形質細胞（腫瘍含む），TCRBCL, 古典的Hodgkinリンパ腫．DLBCLの約4割
 　(Torlakovic E et al. Am J Pathol 2001)．

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参考論文その他
Boyd SD, Natkunam Y, Allen JR, Warnke RA. Selective immunophenotyping for diagnosis of B-cell neoplasms: immunohistochemistry and flow cytometry strategies and results. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2013 Mar;21(2):116-31.